Комплект за имунопреципитация (протеинови A/G магнитни перли)

IP или Co-IP е обичайна експериментална техника за изследване на протеинови или протеин-протеинови взаимодействия (PPI) чрез използване на специфични антитела и среда, която свързва антитела (напр. протеин A/G агароза или протеин A/G магнитни перли), или директно използване среда, свързана със специфични антитела (напр. агарозни гелове или магнитни перли), и след това изолиране на комплексите антиген-антитяло от сложните протеинови проби чрез центрофугиране или магнитна сила, която впоследствие може да се използва за Western blot или мас спектрометрия. Протеин G е имуноглобулин свързващ протеин, експресиран отСтрептококови бактериитип C или G. Протеин А е протеин на повърхността на клетъчната стена, открит вСтафилококус ауреусс молекулно тегло 42kDa. Протеин A и протеин G са функционално сходни и могат да се свързват специфично с имуноглобулин на бозайник (Ig). Рекомбинантен протеин A и G с подходящи модификации, свързани с магнитни перли, може да се използва за имунопреципитация или пречистване на антитяло. Магнитните зърна на протеин А са подходящи за имунопреципитация на човешки IgG1, IgG2, IgG4, миши IgG2a, IgG2b, докато магнитните зърна на протеин G са подходящи за имунопреципитация на човешки IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, миши IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 , плъши IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c поликлонални антитела. (Вижте таблица I за конкретна информация)

Този продукт използва самостоятелно разработените и произведени белязани с белтък протеин A/G магнитни перли, в сравнение с подобни продукти на пазара, този продукт свързва антителата по-ефективно и има по-ниска неспецифична скорост на свързване, заедно с оптимизирания буфер, той може да бъде удобен и ефективен за експерименти с имунопреципитация; може да се използва широко в изолирането и пречистването на целевите протеини в проби като клетъчни лизати, супернатанти на клетъчна секреция, серум, асцит и др.; Този комплект предоставя два метода на елуиране (денатуриращо елуиране и киселинно елуиране) за елуиране на целевия протеин, особено киселинното елуиране няма да съдържа леките и тежките вериги на антитялото, което може ефективно да реши проблема с намесата на тежката и леката част на антитялото вериги в експериментите с имунопреципитация и протеинов имуноблотинг.

Кораб с мокър лед; Буферът за зареждане на 5X SDS-PAGE (намален) трябва да се съхранява при -20 градуса и други при 2-8 градуса за 12 месеца.

1. Подготовка на комплекта

a) Вижте таблицата по-долу, пригответе съответните реактиви в съотношение 100-500 μL лизат на проба;

b) Приготвяне на IP лизат, съдържащ протеазен инхибитор: Вижте горната таблица, използвайте {{0}} μL IP лизат, съдържащ протеазен инхибитор на 0.5-1 милиона клетки за лизис; смесете IP лизата с 50x Cocktail протеазен инхибитор (препоръчва се G2006-250UL) в съотношение 50:1, например добавете 20 μL 50x Cocktail протеазен инхибитор в 1 mL IP лизат, след това 1 mL от Ще бъде получен IP лизат, съдържащ протеазен инхибитор; приготвеният IP лизат, съдържащ инхибитора, трябва да се постави в ледена баня или при 4 градуса.

c) Забележка: Ако целевият протеин на имунопреципитацията включва модификация на фосфорилиране или ацетилиране, трябва да се добави инхибитор на фосфатаза или инхибитор на деацетилаза (самоосигурен); Инхибиторът, съдържащ IP лизат, трябва да се приготви преди употреба и не трябва да се замразява и съхранява за последваща употреба.

d) Приготвяне на 1 × TBS: Разредете 10 × TBS буфер с ултра-чиста вода до 1 × TBS. Например, добавете 1 mL 10 × TBS буфер към 9 mL ултра-чиста вода, което е 1 × TBS буфер, след като разбъркате добре.

e) Приготвяне на 1x SDS-PAGE зареждащ буфер (редуциран): подходящо количество от 5x SDS-PAGE зареждащ буфер (редуциран) се разрежда 5 пъти с ултра-чиста вода, за да се получи 1x SDS-PAGE зареждащ буфер (редуциран); например, смесете 0.2mL от 5x протеинов буфер (редуциран) с 0.8 mL ултра-чиста вода, което е 1x SDS-PAGE зареждащ буфер (редуциран).

2. Подготовка на антигенна проба

Експериментите за имунопреципитация или имунопреципитация трябва да се извършват веднага след лизиране на пробите, ако не, пробите могат да се съхраняват в хладилник при -20 градуса или -80 градуса, но замразяването и размразяването може да повлияе на протеин-протеинови взаимодействия; всички етапи на лизис на пробата трябва да се извършват в ледена баня или при 4 градуса, за да се сведе до минимум разграждането на протеина, и определено количество от пробата трябва да се вземе като вход или обща стойност, след като пробата е била подготвена за последващо откриване от Western Blot.

За тъканни проби:

а) Тъканите трябва да се изплакнат в предварително охладен PBS, за да се отстрани напълно излишната кръв. Претегля се и се смила на малки парчета в хомогенизатор върху лед.

b) Добавете протеазния инхибитор, съдържащ IP лизат, в съотношение 100-200 μL на 10-20 mg тъкан или намалете количеството IP лизат, ако са необходими по-високи концентрации на протеин.

в) Хомогенизирайте със стъклен хомогенизатор или ръчен хомогенизатор или използвайте нашата собствено разработена нискотемпературна мелница KZ-III-F за пълно смилане.

d) Хомогенатът се прехвърля в 1.5 mL центрофужна епруветка, разклаща се и се смесва и се къпе в лед за 30 минути, като се продухва повторно с пипета на всеки 10 минути, за да се осигури пълен лизис на тъканните клетки.

e) Центрофугирайте при 12,000 xg за 5 минути при 4 градуса, изхвърлете утайката и аспирирайте супернатантата за последващи имунопреципитационни или имунопреципитационни експерименти.

За прилепнали клетъчни проби:

a) Ако е необходимо, клетките могат да бъдат промити 2-3 пъти с PBS, като остатъчната течност се абсорбира старателно последния път.

b) Изстържете клетките с клетъчен скрепер или трипсин разградете клетките, за да ги направите напълно суспендирани, съберете ги в 1,5 mL центрофужна епруветка и центрофугирайте при 1,000 xg за 5 минути при 4 градуса, изхвърлете супернатантата, за да съберете клетъчната утайка.

c) Добавете {{0}} μL от IP лизат, съдържащ протеазен инхибитор на 0.5-1 милиона клетки (еквивалентно на една ямка от 6-плака с ямки); обдухване по подходящ начин и ледена баня за 3-5 минути за пълно лизиране на клетките и не трябва да има видима клетъчна утайка след пълното лизиране; ако количеството клетки е по-голямо, се препоръчва клетките да бъдат разделени на 0.5-1 милиона клетки/епруветка до пълно лизиране.

d) Центрофугирайте при 12,000 xg за 5 минути при 4 градуса, изхвърлете утайката и аспирирайте супернатанта за последваща имунопреципитация или експерименти с имунопреципитация.

За суспендирани клетъчни проби:

а) Центрофугирайте при 1000 g за 5 минути при 4 градуса за събиране на утайката; ако е необходимо, измийте веднъж с PBS, след това аспирирайте остатъчната течност и внимателно разклатете, за да разпръснете клетките колкото е възможно повече.

b) Добавете {{0}} μL от IP лизат, съдържащ протеазен инхибитор на 0.5-1 милиона клетки (еквивалентно на една ямка от 6-плака с ямки); обдухване по подходящ начин и ледена баня за 3-5 минути за пълно лизиране на клетките; ако количеството клетки е по-голямо, се препоръчва клетките да бъдат разделени на 0.5-1 милиона клетки/епруветка до пълно лизиране.

в) Центрофугирайте при 12,000 xg за 5 минути при 4 градуса, изхвърлете утайката и аспирирайте супернатантата за последващи имунопреципитационни или имунопреципитационни експерименти.

За проби от бактерии или дрожди:

а) Вземете 1 mL бактериален или дрожден разтвор и центрофугирайте, за да отстраните супернатантата. Ако е необходимо, клетките могат да бъдат промити веднъж с PBS, като остатъчната течност се абсорбира старателно последния път. Внимателно разбъркайте, за да разпръснете клетките колкото е възможно повече.

b) Добавете 100-200 μL IP лизат, съдържащ протеазен инхибитор, и издухайте внимателно, за да разпръснете напълно бактериите или гъбичките.

c) Ледена баня за 10 минути, за по-добро лизиране, бактериите и дрождите могат да бъдат усвоени съответно с лизозим и ензим за разрушаване на стените (осигурен от себе си) и след това лизирани с IP лизат, съдържащ протеазни инхибитори.

d) Центрофугирайте при 12,000 xg за 5 минути при 4 градуса, изхвърлете утайката и аспирирайте супернатанта за последваща имунопреципитация или експерименти с имунопреципитация.

3. Подготовка на магнитни перли

a) Внимателно ресуспендирайте магнитните зърна SweMagrose Protein A/G, за да образувате колкото е възможно повече хомогенна дисперсия на зърна, добавете 20 ul добре смесена дисперсия на зърна за всеки 500 ul проба, вземете подходящо количество магнитен гранули в чиста EP епруветка и добавете 1x TBS до краен обем от 0,5 mL (20 ul топчета дисперсия за всяка проба се използва в следващите етапи на имунопреципитация като пример).

b) Внимателно ресуспендирайте магнитните перли, поставете ги върху стойка за магнитно разделяне за 30 s, внимателно отстранете супернатантата и повторете горните стъпки два пъти.

c) Магнитните зърна се ресуспендират с 1x TBS според обема на първоначалната дисперсия на зърната.

4. Антитяло, свързващо се с магнитни топчета SweMagrose Protein A/G

a) Приготвяне на антитяло: разредете антитялото с 1x TBS, за да приготвите работния разтвор на антитялото според съотношението на разреждане, препоръчано в инструкциите за антитялото, или пригответе антитялото в работен разтвор на антитялото с крайна концентрация 5-50 ug/mL , които могат да се приготвят върху лед;по избор:използвайте нормален IgG от същия вид антитяло, за да приготвите нормален работен разтвор на IgG със същото съотношение на разреждане или крайна концентрация от 5-50 ug/mL, отстранете неспецифичното свързване или послужете като отрицателна контрола. Нормалният IgG от същия вид означава, че ако антитялото, използвано при последваща имунопреципитация, е миши IgG, подходящо количество нормален миши IgG може да се разреди с 1x TBS в тази стъпка, за да се намали фона или като отрицателна контрола.

b) Адсорбция на антитяло: Разделете магнитните зърна SweMagrose Protein A/G, приготвени в стъпка 3 чрез магнит, аспирирайте супернатантата, добавете 500 μL работен разтвор на антитяло или нормален работен разтвор на IgG, ресуспендирайте и след това инкубирайте за 15-60 минути при стайна температура на оборотен миксер.

Забележка: Възможно е също да се инкубират магнитните зърна SweMagrose Protein A/G, приготвени в стъпка 3, директно с подходящо количество антитяло или нормален IgG.

c) Магнитно разделяне и промиване: Разделете инкубираните гранули чрез магнит, аспирирайте супернатантата, добавете 500 μL от 1 × TBS, ресуспендирайте гранулите SweMagrose Protein A/G чрез внимателно продухване с пипета, поставете върху стелаж за магнитно разделяне за 10 s , отстранете супернатантата, повторете промиването три пъти и ресуспендирайте перли с 1 × TBS в същото количество като първоначалния обем.

Забележка: Ако зърната са агломерирани или люспести по време на инкубация и измиване, това е нормално явление и няма да повлияе на експерименталните резултати.

5. Имунопреципитация (IP):

a) Отстраняване на неспецифичното свързване (по избор): гранулите SweMagrose Protein A/G, приготвени в стъпка 4, които свързват нормален IgG, се инкубират с пробите при 4 градуса за 60 минути и се разделят чрез магнитно изсмукване, а супернатантите се използвани за следващите експерименти; целта на тази стъпка е да се премахнат протеините, които се свързват неспецифично с нормалния IgG.

b) Инкубация на проби с гранули SweMagrose Protein A/G, конюгирани с антитяло или нормален IgG: добавете гранули SweMagrose Protein A/G, конюгирани с антитяло или нормален IgG в съотношение 20 ul суспензия от гранули за всеки 500 ul протеинова проба, поставете върху шейкър със странична осцилация или ротационен миксер и инкубирайте 2 часа на стайна температура или през нощта при 4ºC.

Бележка 1: Ако перлите са агломерирани или люспести по време на инкубация и измиване, това е нормално явление и няма да повлияе на експерименталните резултати.

Бележка 2: Алтернативно, подходящото количество антитяло или нормален IgG може да се инкубира с пробата за 1-2 часа при стайна температура или цяла нощ при 4 градуса и след това може да се добави 10-20 μL суспензия от магнитни перли и се инкубират за 60 минути при стайна температура.

в) Магнитно разделяне: след инкубиране поставете върху стойка за магнитно разделяне за 10 секунди, за да отстраните супернатантата.

Забележка:Запазете част от супернатанта, за да тествате ефекта на имунопреципитацията.

d) Промиване: Добавете 500 ul от 1 × TBS, внимателно издухайте ресуспендираните перли с пипета, поставете върху магнитен сепаратор за 10 секунди, за да отстраните супернатантата и повторете промиването три пъти.

Забележка: Можете също така да тествате OD280 на разтвора за измиване, за да определите дали измиването е завършено, ако OD280 е повече от 0,05, броят пъти на измиване трябва да се увеличи по подходящ начин.

6. Елуиране

В зависимост от характеристиките на целевия протеин и изискванията на следващите експерименти, един от следните методи може да бъде избран за елуиране.

a) Метод на денатуриращо елуиране:Пробите, елуирани по този метод, са подходящи за SDS-PAGE. Извадете EP епруветката от магнитния сепаратор, добавете 25 µL от 1 × протеинов буфер за вземане на проби (редуциран) към епруветката, загрейте при 95 градуса за 5 минути и след това извършете магнитно разделяне, за да съберете супернатантата за Western blot откриване.

b) Киселинно елуиране:Пробата, елуирана по този метод, запазва първоначалната си биологична активност и може да се използва за пост-функционален анализ. Извадете EP епруветката от стойката за магнитно разделяне, добавете 20 µL киселинен елуиращ буфер към епруветката, разбъркайте добре и инкубирайте при стайна температура за 10 минути, след това извършете разделяне с магнитно изсмукване, съберете супернатантата в нова EP епруветка и незабавно добавете 2 µL неулизиращ буфер за елуиране, за да коригирате рН на елуирания продукт до неутрално, което може да се използва за постфункционален анализ.

Забележка: Потребителят може да регулира количеството добавен елуиращ буфер според желания обем.

1. Не съхранявайте SweMagrose Protein A/G в комплекта при -20 градуса или замразявайте и размразявайте многократно, в противен случай това ще повлияе на работата на магнитните перли и ще причини ненужни експериментални грешки.

2. Моля, прочетете внимателно тези инструкции, преди да извършите процедурата за имунопреципитация.

3. Рамка за магнитно разделяне за магнитно разделяне трябва да се осигури самостоятелно

4. Ако имунопреципитираният целеви протеин включва модификация на фосфорилиране или ацетилиране, трябва да се осигурят подходящи инхибитори на фосфатаза и инхибитори на деацетилаза.

5. Поддържайте зърната при рН 6-8, избягвайте високоскоростно центрофугиране, сушене или замразяване; не излагайте зърната на магнитни полета за дълги периоди от време, което може да причини агломерация на зърната.

6. Перлите трябва да се разбъркат старателно преди употреба, операцията по смесване трябва да бъде нежна и не трябва да се подлага на силно въртене и разклащане, за да се избегне денатуриране на антитялото.

7. Препоръчват се положителни и отрицателни контроли (SweMagrose Mouse IgG) при имунопреципитация.

8. Протеиновите проби трябва да се пречистват възможно най-скоро след вземането им и винаги да се поставят на 4 градуса или в ледена баня, за да се забави разграждането или денатурацията на протеина

9. Магнитните зърна могат да се съберат, когато се използват с киселинно елуиране, което е нормално явление и не засяга нормалната употреба на магнитни зърна.

10. Само за изследователска употреба. Не се използва при диагностични или терапевтични процедури.

11. Носете подходящо защитно облекло като лабораторни гащеризони, предпазни очила и ръкавици.

12. Свързващият капацитет на протеин A и протеин G към антитела от различни генерични източници и подтипове е показан в таблица I.

Таблица 1

Само за изследователска употреба. Да не се използва при диагностични или терапевтични процедури!

Популярни тагове: комплект за имунопреципитация (протеин a/g магнитни перли), Китай комплект за имунопреципитация (протеин a/g магнитни перли) производители, доставчици, фабрика