TSAPLus флуоресцентен комплект за двойно оцветяване (зелен IF488+ червен IF594）

Име на продукта	котка не	спец.
TSAPLus флуоресцентен комплект за двойно оцветяване (Зелен iF488+ Червен iF594)	G1259-50T	50 T
	G1259-100T	100T

 

 

 

TSAPLus флуоресцентен комплект за двойно оцветяване (IF488+ Red iF594) на този продукт е подходящ за двойно имунофлуоресцентно оцветяване на парафинови срезове, особено за двойно флуоресцентно имуномаркиране на първични антитела от един и същи източник, както и за двойно флуоресцентно имуномаркиране на антитела от различни източници. Основният принцип се основава на усилване на сигнала Tyramide (TSA), наричано по-нататък TSA технология. Основният принцип на TSA технологията е да се използва пероксидазната реакция на Тирамид (т.е. флуоресцентно белязаната тирамидна сол образува място за свързване на ковалентна връзка под H2O2, катализиран от HRP) за генериране на голям брой ензимни реакции. Продуктът се свързва с околните протеинови остатъци (включително триптофанови, хистидинови и тирозинови остатъци) и образува голямо количество флуоресцеинови отлагания в мястото на свързване на антиген-антитяло, което позволява усилване на сигнала. Множествено флуоресцентно оцветяване може също да бъде постигнато чрез многократно повтарящо се имуномаркиране с различни флуоресцентни тирамини. В сравнение с G1235, друг TSA флуоресцентен комплект за двойно оцветяване на нашата компания, този комплект замества FITC-Tyramide и CY3-Tyramide с iF488-Tyramide и iF594-Tyramide с по-силна и по-стабилна флуоресценция сигнали, които са подобрени версии на G1235.

 

 

 

Тип флуоресцентно багрило	Ex/nm	Em/nm
DAPI	359	457
iF440-Тирамид	434	480
iF488-Тирамид	491	516
iF546-Тирамид	541	557
iF555-Тирамид	557	570
iF594-Тирамид	588	604
iF647-Тирамид	656	670
iF700-Тирамид	690	713
iF750-Тирамид	757	779

 

 

 

Всеки компонент в комплекта беше съхраняван в съответствие с необходимите условия и транспортиран в мокри пакети с лед. Валидна е 12 месеца.

 

 

 

Номер на компонента	Компонент		G1259-50T	G1259-100T	Съхранение
G1259-1	iF488-Тирамид		25 μL	2×25 μL	-20 степен
G1259-2	iF594-Тирамид		25 μL	2×25 μL	-20 степен
G1259-3	Тирамиден разредител		100 мл	2×100 мл	4 степен
G1259-4	DAPI (готов за използване)		10 мл	20 мл	4 степен
G1259-5	Тъканно гасене на автофлуоресценция		10 мл	20 мл	Стайна температура
G1259-6	Анти-флуоресцентен гасител		5 мл	10 мл	-20 степен
Ръководство за продукта			1 бр

 

 

 

Подготовка преди експеримента:

1. Пригответе 0.01 mol/L PBS буфер (pH7.0-7.4, препоръчва се G4202 или G0002), 3% H2O2 и 0,3% H2O2;

2. Пригответе първично антитяло и съответно HRP-маркирано вторично антитяло, разтвор за възстановяване на антиген (изберете подходящ разтвор за възстановяване на антиген според антитяло и тип тъкан);

3. В съответствие с дозировката, пригответе работен разтвор за оцветяване с TSA според пропорцията в таблицата по-долу.

TSA оцветяващ работен разтвор	Реактив елемент	Обем
TSA-488 разтвор за оцветяване	Тирамиден разредител	1 мл
	0.3% H2O2	10 μL
	iF488-Тирамид	2 μL
TSA-594 разтвор за оцветяване	Тирамиден разредител	1 мл
	0.3% H2O2	10 μL
	iF594-Тирамид	2 μL

Забележка: След като флуоресцентният Тирамид се разтопи, центрофугата се центрофугира за кратко време и чистата смукателна глава се продухва и се смесва. Препоръчва се разтворът за оцветяване с TSA да се приготви и използва сега. Трябва да се съхранява при 4 градуса на тъмно и да действа в рамките на 24 часа.

стъпки:

Вземайки тъканни срезове като пример, експерименталната вода, използвана в следните експериментални стъпки, беше чиста вода:

1. Депарафинизирани тъканни срезове във вода;

2. Възстановяване на антигена: Според използваното първично антитяло и вида на пробата са използвани подходящи методи за възстановяване на антигена на тъканни срезове;

3. Измийте тъканта с PBS 3 пъти, 5 минути всеки път и след това начертайте кръгови маркировки върху тъканта с IHC писалка;

4. Инактивиране на ендогенна пероксидаза: към срезовете се добавя 3% H2O2 за покриване на тъканта и се инкубира при стайна температура на тъмно в продължение на 25 минути, за да се блокира ендогенната пероксидаза и да се намали неспецифичното фоново оцветяване. Промийте с PBS 3 пъти, 5 минути всеки път;

5. Запечатване: След като срезовете бяха леко изсушени, към тъканта беше добавен 3% BSA или серум за блокиране за 30 минути. Запечатващият реагент се определя според вида първично антитяло и вторично антитяло.

6. Първична инкубация на антитяло: Разредете първичното антитяло до подходящата концентрация с PBS (или друг разредител на антитела). Внимателно отстранете течността от среза, добавете разреденото първично антитяло, за да покриете тъканта, и поставете среза плосък в мокра кутия с вода и инкубирайте една нощ при 4 градуса C. Измийте с PBS 3 пъти, 5 минути всеки път;

7. Инкубация на HRP вторично антитяло: Разредете вторичното антитяло до подходяща концентрация с PBS (или друг разредител на антитяло), добавете вторичното антитяло към тъканта и инкубирайте при стайна температура за 50 минути. Промийте с PBS 3 пъти, 5 минути всеки път;

8. Добавете 50-100 μL TSA-488 оцветяващ работен разтвор към тъканта, за да осигурите пълно покритие на тъканта, и инкубирайте при стайна температура за 10 минути на тъмно. Промийте с PBS 3 пъти, 5 минути всеки път;

9. Микровълнова обработка: Тъканните срезове се поставят в кутия за възстановяване, пълна с разтвор за възстановяване на антиген (подходящ разтвор за възстановяване на антиген, избран според типа тъкан и антитяло) за обработка с микровълново нагряване за отстраняване на свързаните първични и вторични антитела. (Температура и време на нагряване: нагряване до 95 градуса или повече, поддържайте 15 минути.) По време на тази стъпка, предотвратете прекомерното изпаряване на течността, водещо до сухи люспи.

10. Повторете стъпка 6 за инкубиране на второто първично антитяло: Разредете второто антитяло (първично антитяло) до подходящата концентрация с PBS (или друг разредител на антитяло). Внимателно разклатете течността върху среза, капнете разреденото антитяло, за да покриете тъканта, и поставете среза в мокра кутия с вода и инкубирайте една нощ при 4 градуса C. Измийте с PBS 3 пъти, 5 минути всеки път;

11. Повторете стъпка 7, за да инкубирате съответното HRP вторично антитяло: разредете вторичното антитяло до подходяща концентрация с PBS (или друг разредител на антитяло), добавете вторичното антитяло към тъканта и инкубирайте при стайна температура за 50 минути. Промийте с PBS 3 пъти, 5 минути всеки път;

12. Добавете 50-100 μL TSA-594 оцветяващ разтвор към тъканта, за да осигурите пълно покритие на тъканта, и инкубирайте при стайна температура за 10 минути на тъмно. Промийте с PBS 3 пъти, 5 минути всеки път;

13. Ядрено контрастно оцветяване DAPI: След като срезовете бяха леко изсушени, DAPI (готов за употреба) разтвор за оцветяване беше добавен към тъканите на капки и инкубиран за 10 минути при стайна температура на тъмно. Промийте с PBS 3 пъти, 5 минути всеки път;

14. Потушаване на тъканна автофлуоресценция (по избор): Добавете средство за потушаване на тъканна автофлуоресценция (суданско черно) към тъканта, инкубирайте при стайна температура за 5 минути, изплакнете с течаща вода за 3 минути;

15. Запечатване и микроскопско изследване: След като срезовете са леко изсъхнали, капнете анти-флуоресцентно потушения запечатващ агент, за да запечатате срезовете. За наблюдение и събиране на изображения са използвани флуоресцентен микроскоп или лазерен конфокален микроскоп. Резените могат да се съхраняват при 4 градуса C в продължение на 15 дни в защитена от светлина кутия.

 

 

 

1. В сравнение с флуоресцентно вторично антитяло, комплектът TSA има по-висока чувствителност и по-силен сигнал. Следователно концентрацията на първичното антитяло трябва да бъде намалена и разреждането, препоръчано от ръководството за антитяло, трябва да се увеличи 5-10 пъти, за да се намали фоновата флуоресценция, причинена от неспецифичното свързване. Препоръчва се да се зададе градиентна концентрация на първичното антитяло, за да се постигне най-добър ефект.

2. Ако фоновата флуоресценция е силна, добавете стъпка за потушаване на тъканната автофлуоресценция.

3. Препоръчителното съотношение на разреждане на флуоресцентния Tyramide е 1:500 и съотношението на разреждане може да се регулира според експерименталните резултати (диапазон на регулиране: 1:200-1:1000).

4. За многократно флуоресцентно маркиране се препоръчва първо да се инкубира поликлоналното антитяло и след това моноклоналното антитяло; първо се инкубира антитялото, съответстващо на прицелния протеин с високо изобилие, и след това антитялото, съответстващо на прицелния протеин с ниско изобилие, се инкубира.

 

 

Само за изследователска употреба!