JC-1 Комплект за анализ на потенциала на митохондриалната мембрана

 

име на продукта	Идентификация на продукта	модел
JC-1 Комплект за анализ на потенциала на митохондриалната мембрана	G1515-100T	100T

 

 

JC-1 е катионно карбонилно цианиново багрило, което може да премине през клетъчната мембрана и да се агрегира към митохондриите под действието на потенциала на митохондриалната мембрана. Това е идеална флуоресцентна сонда, широко използвана за откриване на потенциала на митохондриалната мембрана. Когато потенциалът на митохондриалната мембрана е висок, багрилото се агрегира в матрицата на митохондриите, показвайки червена флуоресценция (Ex=585 nm,Em=590 nm); Когато потенциалът на митохондриалната мембрана е нисък, JC{{3 }} е предимно мономер, който съществува в цитоплазмата и показва зелена флуоресценция (Ex=514 nm,Em=529 nm). Следователно, промяната на потенциала на митохондриалната мембрана може да се прецени според трансформацията на цвета на флуоресценцията и промяната на пропорцията, а намаляването на потенциала на митохондриалната мембрана също е важен маркер за ранна апоптоза .

JC-1 Комплект за анализ на потенциала на митохондриалната мембрана е базиран на JC-1 флуоресцентна сонда, която е подобрила проблема с лесното утаяване и други недостатъци. Този комплект може да се използва за бързо и чувствително откриване на потенциални промени в митохондриалната мембрана в клетките или пречистени митохондрии за определяне на ранната апоптоза и също така е често срещан метод, използван за откриване на ранна клетъчна апоптоза. В този комплект могат да бъдат тествани общо 100 6-проби от плаки с ямки.

В допълнение, този комплект също така осигурява CCCP (карбонил цианид 3-хлорофенилхидразон) реагент, протонен носител (водороден йонофор) и разделител на окислителното фосфорилиране в митохондриите, което може да насърчи промените в пропускливостта на митохондриите за водородни йони, което води до намаляването или загубата на потенциала на митохондриалната мембрана, което може да се използва като положителна контрола за предизвиквайки намаляване на потенциала на митохондриалната мембрана.

 

 

JC-1 багрило (500×) трябва да се съхранява при -20 градуса, изсушено и защитено от светлина и да се избягва повторно замразяване и размразяване;

JC-1 буфер и JC-1 разредител могат да се съхраняват при 4 градуса. Валиден 12 месеца.

 

 

Номер на компонента	Компонент	G1515-100T
G1515-1	JC-1 багрило (500 ×)	4 x 50 μL
G1515-2	JC-1 буфер (10 x)	50 мл
G1515-3	JC-1 разредител	100 мл
G1515-4	CCCP (100 тМ)	50 μL
Наръчник		1 бр

 

 

1. пригответе работния разтвор на JC-1 багрило(2x) и JC-1 буфер(1x):

а. Вземете 2 μL разтвор на JC-1 (500×) и 900 μL разтвор за разреждане на JC-1 и разбъркайте добре, след това добавете 100 μL JC-1 буфер (10×) и разбъркайте добре чрез завихряне и разклащане, за да подготвите JC-1 работен разтвор за резервна употреба (внимавайте да подготвите този разтвор по ред);

b. Вземете подходящо количество JC-1 буфер (10×), разреден с дейонизирана вода, за да формулирате 1×JC-1 буфер и оставете настрана (1×JC-1 буфер се използва за следващите стъпки, като измиване, ако не е посочено друго).

2. подгответе положителна контрола (по избор):

а. Вземете подходящо количество CCCP (100 mM) и разредете 1000 пъти със среда за клетъчна култура, за да получите 100 μM CCCP работен разтвор;

b. Инкубирайте клетките с работен разтвор на CCCP за около 30 минути и след това следвайте процедурата за оцветяване с JC-1 по-долу, за да откриете потенциала на митохондриалната мембрана.

Забележка: За повечето клетки, след третиране с горните лечения, в сравнение с нормалната група, може да се види, че JC-1 съществува предимно в цитоплазмата като мономери след индуциране чрез третиране с CCCP, показвайки по-ярка зелена флуоресценция и по-слаба червена флуоресценция; За някои клетки обаче концентрацията и времето за инкубация на CCCP може да са различни, моля, направете справка или направете експеримент, за да намерите оптималните условия.

3. Клетъчно оцветяване и анализ

а. Вземете 1-6×105 клетки, центрофугирайте при 1000 g за 3-5 минути, за да отстраните оригиналната среда, добавете JC-1 буфер и промийте веднъж, след това центрофугирайте, за да отстраните JC-1 буфера и ресуспендирайте с 500 μL среда за клетъчна култура (може да се включи серум и фенолово червено);

b. След това добавете 500 μL JC-1 работен разтвор и инкубирайте в CO2 инкубатор за 15-30 минути (обикновено 20 минути са достатъчни или времето за инкубация може да се коригира според ситуацията), защитено от светлина;

c. В края на инкубацията клетките все още бяха третирани като конвенционални суспензионни клетки и след центрофугиране за отстраняване на JC-1 работния разтвор, клетките бяха промити два пъти с JC-1 буфер;

d. След ресуспендиране в подходящо количество JC-1 буфер (1×) или разтвор на клетъчна култура (препоръчва се без фенолно червено), той се наблюдава с флуоресцентен микроскоп или лазерен конфокален микроскоп или се анализира с поточна цитометрия и други инструменти.

4. Операция за оцветяване на прилепнали клетки (6-плака с ямки като пример):

За прилепнали клетки, ако трябва да бъдат открити чрез поточна цитометрия, клетките могат първо да бъдат събрани, ресуспендирани и след това отнесени към анализа за суспензионни клетки.

а. След отстраняване на оригиналната среда за клетъчна култура, съдържаща лекарства или други лечения, добавете 1 mL JC-1 буфер и измийте 1-2 пъти;

b. Добавете 1 mL среда за клетъчна култура (може да съдържа серум и фенолово червено);

c. Добавете 1 mL JC-1 работен разтвор, разклатете внимателно, за да се смеси добре, и инкубирайте за 15-30 минути в CO2 инкубатор, защитен от светлина;

d. В края на инкубацията супернатантата се аспирира и с JC-1 буфер се промива два пъти;

д. Добавете 2 mL JC-1 буфер (1×) или разтвор на клетъчна култура (препоръчва се без фенолно червено);

f. Наблюдава се под флуоресцентен микроскоп или лазерен конфокален микроскоп или се анализира с инструмент като поточен цитометър.

5. За извличане на пречистени митохондрии

а. 900 μL JC-1 работен разтвор беше допълнен със 100 μL общ протеин, възлизащ на 10-100 ug пречистени митохондрии;

b. След смесване, той беше сканиран и открит с помощта на инструмент като флуоресцентен спектрофотометър (с дължина на вълната на възбуждане 485 nm и дължина на вълната на излъчване 590 nm) или инструмент за маркиране на ензим (когато дължината на вълната на възбуждане не можеше да бъде настроена на 485 nm, дължината на вълната на възбуждане може да бъде зададена в рамките на 475-520 nm), или може да се наблюдава чрез флуоресцентна или лазерна конфокална микроскопия, която може да бъде открита по отношение на настройката на дължината на вълната в стъпка 6.

6. Откриване и анализ на флуоресценция

а. Параметрите на дължината на вълната за откриване на JC-1 мономер са Ex=490 nm, Em=525 nm; параметрите на дължината на вълната за полимер JC-1 са Ex=525 nm, Em=590 nm; имайте предвид, че не е необходимо да се задават възбуждането и излъчването при максималните дължини на вълната на възбуждане и излъчване при определянето на флуоресценцията тук и че настройките на параметрите могат да се регулират според ситуацията около този параметър;

b. Когато правите снимки с флуоресцентен микроскоп, се препоръчва да използвате нормалната група като стандарт за определяне на времето на експозиция за червена и зелена флуоресценция, така че червеният флуоресцентен ефект на нормалната група да е ясен, а зеленият флуоресцентен ефект да е по-тъмен, и да се направят снимки на флуоресценцията на обработващата група с времето на експозиция съответно за червена и зелена флуоресценция на нормалната група;

4. Преценка на резултатите: състоянието на клетката е нормално, показва главно червена флуоресценция, което показва, че потенциалът на нейната митохондриална мембрана е нормален; ако има значително увеличение на зелената флуоресценция, което показва, че потенциалът на митохондриалната мембрана е намалял, което може да е в ранен стадий на апоптоза.

 

 

1. За да разтворите напълно JC-1, следвайте последователността на операциите за приготвяне на JC-1 работен разтвор.

2. Препоръчва се пробите да се тестват в рамките на 30 минути след инкубацията на JC-1.

3. JC-1 разтвор, JC-1 буфер (10×) може да се разтвори в подходяща топла баня, ако се получи утайка.

4. За финалния анализ на JC-1 се препоръчва да се използва разтвор на клетъчна култура без фенол червено, за да се избегне интерференция на цвета на фона, а фенолово червено на инкубационния етап на оцветяване с JC-1 няма ефект върху резултатите .

5. Ако се използва по-малко JC{1}} разтвор наведнъж, което може да включва многократно повторно замразяване и размразяване, моля, дозирайте според случая и се опитайте да избегнете многократно повторно замразяване и размразяване на JC{2}} разтвор.

6. Моля, носете лабораторна престилка и ръкавици за еднократна употреба по време на работа.

 

Само за изследователска употреба!

 

 

Популярни тагове: jc-1 комплект за анализ на потенциала на митохондриалната мембрана, Китай jc-1 комплект за анализ на потенциала на митохондриалната мембрана производители, доставчици, фабрика